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1.1.3  Aufbau und Wirkungsweise von Enzymen

Biokatalyse

Versuche mit Urease

Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff:

CO(NH₂)₂ + H₂O ---Enzym---> CO₂ + 2 NH₃

praktische Anwendung dieser Reaktion: Harnstoffbestimmung z.B. in Schwimmbadwasser

a) Harnstofflösung wird mit Phenolphthalein versetzt und zum Sieden erhitzt.

Ergebnis: keine Reaktion

b) Harnstofflösung mit konz. Natronlauge erhitzen; in die Dämpfe feuchtes Indikatorpapier halten.

Beobachtung: Geruch nach Ammoniak und alkalische Reaktion

c) 1%ige Harnstofflösung mit Phenolphthalein versetzt (Lösung A) mit Sojabohnenaufschlämmung versetzen.

Beobachtung: Allmählich einsetzende Rotfärbung

d) Lösung A mit Ureasesuspension versetzen.

Beobachtung: Rasch einsetzende Rotfärbung

Ergebnis der Versuche a) - d):

Urease ist ein die Reaktionsgeschwindigkeit steigernder Katalysator, der in biologischem Material vorkommt.

Versuche zum Nachweis der Proteinnatur eines Enzyms:

e) 1 ml Ureasesuspension mit 1 ml Proteaselösung versetzen. Parallelansatz: 1 ml Ureasesuspension mit 1 ml Wasser verdünnen. Beide Ansätze 30 - 60 min in einem 40°C warmen Wasserbad stehenlassen, dann zu Harnstofflösung geben.

Beobachtung: langsamere Rotfärbung im proteasehaltigen Ansatz.

f) In 4 Rg. gibt man je 1 ml Ureasesuspension

Rg 1: Kontrolle

Rg 2: Kupfersulfatlösung zugeben

Rg 3: Aceton zugeben

Rg 4: zum Sieden erhitzen

Anschließend Zugabe von Lösung A

Beobachtung: Rotfärbung nur in Rg1

Ergebnis der Versuche e) - f): Urease ist ein Protein, denn es wird durch proteinspaltende Enzyme abgebaut und durch Denaturierung geht die katalytische Eigenschaft verloren.

Die meisten biochemischen Reaktionen würden trotz negativen DG-Werten außerordentlich langsam ablaufen, denn in den niedrigen Temperaturbereichen, in denen sich die Lebensvorgänge abspielen, erreichen nur wenige Moleküle die zur Überwindung des Energieberges notwendige Aktivierungsenergie.

Diese Reaktionen werden durch Enzyme beschleunigt, das sind Proteine mit katalytischen Eigenschaften.

Wiederholung: Darstellung der Katalysatorwirkung in einem Energiediagramm:

• Ein Katalysator beschleunigt eine chemische Reaktion durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie.

• Er beeinflusst jedoch nicht die Gleichgewichtslage (auch die Rückreaktion wird beschleunigt).

• Er geht aus der Reaktion unverändert hervor

Aufbau der Enzyme

Schüssel-Schloss-Prinzip: Das Substrat wird an einer bestimmten Stelle des Enzyms gebunden, dem aktiven oder katalytischen Zentrum.

[Modell_Skizze]

Einteilung:

Wirkungsweise von Coenzymen und prosthetischen Gruppen

Coenzyme wirken als Wasserstoff- oder Gruppenüberträger (z.B. ATP als Überträger von Phosphatgruppen)

Strukturelle Beziehung der Coenzymen zu den Vitaminen! 

NAD als wasserstoffübertragendes Coenzym:

 Modellversuch für wasserstoffübertragende Coenzyme:

Wasserstoffübertragung mit Hilfe von Methylenblau (der Farbstoff besitzt ähnliche oxidierende bzw. rduzierende Eigenschaften wie NAD und zeigt dabei einen Farbumschlag.

Durchführung: heißes Wasser mit verd. NAOH alkalisch machen und mit Methylenblau leicht anfärben - keine Veränderung. Zugabe von Glucose: Farbe verschwindet, kommt aber bei starkem Schütteln wieder zum Vorschein.

Aber: statt Enzym Wärmeenergie!

Spezifität der Enzyme: Wirkungs- und Substratspezifität 

Demonstration des Schlüssel-Schloss-Prinzips am Folienmodell

Substratspezifität

Substratspezifität: Es werden nicht alle Stoffe, die eine bestimmte Reaktion eingehen können, umgesetzt.

Vielfach werden bereits strukturell ähnlich gebaute Stoffe nicht mehr umgesetzt, z.B. Spiegelbildisomere

Versuch: Harnstoff und Thioharnstoff mit Urease

Ergebnis: Urease spaltet den strukturell ähnlich gebauten Thioharnstoff nicht.

Wirkungsspezifität

Wirkungsspezifität: Das Enzym katalysiert nur eine von zahlreichen thermodynamisch möglichen Umwandlungen eines Stoffes 

Beispiel:

Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration 

Analog-Modell der Enzymwirkung: Bahnhof

[Zeichnung]

Hemmung der Enzymwirkung - isosterisch (kompetitiv) und allosterisch

Modellvorstellung der Enzymwirkung als Ausgangspunkt (Folienmodell)

E + S <=> ES <=> E + P

Enzym + Substrat <=> Enzym-Substrat-Komplex <=> Enzym + Produkt

Bahnhof als Analogie

Kompetitive (isosterische) Hemmung: Ein Molekül konkurriert mit dem Substrat um die Bindung am katalytischen Zentrum

- Voraussetzung: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Hemmstoff und Substrat

- Durch hohe Substratkonzentrationen aufhebbar (Beispiel: Ethanol gegen Methanolvergiftung)

Allosterische Hemmung: Der Inhibitor wird an einem anderen Ort gebunden als das Substrat und bewirkt eine Konformationsänderung am katalytischen Zentrum.

- Dieser Hemmmechanismus ist durch hohe Substratkonzentrationen nicht aufhebbar.

Beispiel: Endprodukt-Hemmung bei längeren Stoffwechselketten (feedback inhibition)

Das Endprodukt hemmt das erste Enzym der Stoffwechselkette -> Stoffe werden nur bei Bedarf gebildet (Ökonomie des Zellstoffwechsels)

Substratüberschusshemmung: Bei hohen Substratkonzentrationen durch gegenseitige Behinderung am katalytischen Zentrum.

Abhängigkeit der Enzymwirkung von Temperatur, pH-Wert und Ionenmilieu

Temperaturabhängigkeit           pH-Abhängigkeit

Erklärung: Mit dem pH-Wert ändert sich der Ladungszustand der Aminosäure-Seitenketten und damit die Tertiärstruktur des Proteins.

Konstanthaltung des inneren Milieus wichtig!

Ionenmilieu: hemmender oder aktivierender Einfluss bestimmter Ionen (z.B. Rolle der Calciumionen bei der Blutgerinnung)

Aufgaben

Skizzieren Sie die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur in Form eines beschrifteten Diagramms und erklären Sie den Kurvenverlauf.

Erklären Sie unter Verwendung von Formelausschnitten die pH-Abhängigkeit der Enzymwirkung.

Stellen Sie die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion von der Substratkonzentration in einem beschrifteten Diagramm für die folgenden drei Fälle dar (die Enzymkonzentration soll in allen Fällen gleich groß sein):

• Substrat + Enzym

• Substrat + Enzym + kompetitiver Hemmstoff

• Substrat + Enzym + allosterischer Hemmstoff

1.2 Energiebindung und Stoffaufbau durch Photosynthese        

1.2.1 Bedeutung der Photosynthese

Geschichtlicher Rückblick:

Helmonts Versuch (1640) - woher kommt die Pflanze?

Priestley (1770): Luft, die in einem geschlossenen Glasgefäß durch eine brennende Kerze „schlecht“ geworden war, wurde durch die Anwesenheit von Pflanzen wiederhergestellt, so daß auch Tiere darin atmen konnten.

Senebier (1782) erkannte die Bedeutung des Kohlenstoffdioxids

Fischer (1939) Strukturaufklärung des Chlorophylls

evtl. Versuche zum Nachweis der an der Photosynthese beteiligten Stoffe

- Wasserpflanzen - Indigocarmin/Dithionit

- Nachweis der Stärkebildung am Licht: Schablonenversuch

6 CO₂ + 12 H₂O -> C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ + 6 H₂O DH = +2800 kJ

Bedeutung des Photosynthesevorgangs:

- ökologische Schlüsselstellung (Anfang der Nahrungskette)

- Ernährung

- Sauerstoffproduktion

- Weltwirtschaft, regenerative Energie- und Rohstoffquelle

Wirkungsgrad gering, bezogen auf die auf ein Blatt einfallende Strahlungsenergie ca. 1%.

Definitionen:

Autotrophie: Produktion körpereigener organischer Verbindungen aus anorganischen Substanzen mit Hilfe zugeführter Energie

Photosynthese: Umwandlung der energiearmen anorganischen Moleküle CO2 und H2O zu energiereichen Kohlenhydraten und Sauerstoff mit Hilfe von Lichtenergie

Chemosynthese

Hinführung: Stufen der Evolution

- physikalische Evolution

- chemische Evolution (Uratmosphäre - Ursuppe - Miller-Versuch)

- biologische Evolution

Die Protobionten verwendeten Stoffe aus der Ursuppe direkt als Bausteine, sie waren extrem heterotroph - Verknappung - Selektionsdruck - Stoffwechselkette läuft „rückwärts“ - Prokaryonten->Eukaryonten->Vielzeller->Mensch

- kulturelle Evolution

Ernährungsweisen der Lebewesen - Einteilung

Energiequelle

- Licht                           Photosynthese

- chemische Reaktion       Chemosynthese

Kohlenstoffquelle

- Kohlenstoffdioxid        autotroph

- organische Verbindung    heterotroph

Beispiele für chemoautotrophe Lebewesen

Eisenbakterien

Energiegewinnung durch Oxidation von Eisen(II)-ionen zu Eisen(III)-ionen:

Fe2+ -> Fe3+   -DG

Nitrit- und Nitratbakterien

Ammoniak- und Nitritoxidation (Nitrifikation) durch Symbiose von Nitrosomonas und Nitrobacter - Stickstoffkreislauf (pflanzl. Eiweiß -> tier. Eiweiß -> Harnstoff -> Ammoniak -> Nitrit -> Nitrat ->; Gewitter, Denitrifikation)

Knallgasbakterien

2 H2 + O2 -> 2 H2O

Schwefel- und Schwefelwasserst-offoxidierende Bakterien

S -> SO4             S2- -> SO4

Wirkung von Außenfaktoren 

Experimenteller Nachweis des Einflusses von Außenfaktoren auf die Stärkebildung bzw. Sauerstofffreisetzung

Beleuchtungsstärke, Lichtqualität

experimentelle Untersuchung der Blattfarbstoffe, z.B. chromatographische Trennung, Absorptionsmessung; Vergleichen von Absorptionsspektrum des Chlorophylls (vergl.C12.1) und Aktionsspektrum der Photosynthese

Kohlenstoffdioxidgehalt, Temperatur:

Diskussion von Befunden, die auf das Vorliegen lichtabhängiger und lichtunabhängiger Reaktionssysteme hinweisen

Ausgangspunkt: Bruttogleichung der Photosynthese:

6 CO₂ + 12 H₂O -> C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ + 6 H₂O DH=+2800 kJ

Voraussetzungen:

- es muß „aktiver Wasserstoff“ als Reduktionsmittel zur Verfügung stehen (vergl. Oxidationszahl in CH2O = 1/6 Glucose mit CO2)

- Energie muß zugeführt werden (in Form von ATP)

Vorteil der Photosynthese gegenüber der Chemosynthese: allgegenwärtiges Wasser kann genutzt werden.

Begrenzende Faktoren der Photosynthesegeschwindigkeit?

Wasser?

Kohlenstoffdioxid - ist der Gehalt von 0,035% optimal?

Bei hoher Lichtintensität ist die Photosyntheserate über einen weiten Bereich der CO₂-Konzentration proportional

Der niedrige natürliche CO₂-Gehalt der Luft wirkt begrenzend auf die Photosynthese.

Praktische Anwendung: Begasung von Gewächshauskulturen mit CO₂ zur Ertragssteigerung

Licht

Lichtkompensationspunkt: Lichtintensität, bei der die Photosynthese gerade soviel Kohlenstoffdioxid verbraucht, wie bei der gleichzeitig ablaufenden Atmung entsteht.

Schattenpflanzen haben bereits bei niedrigeren Lichtintensitäten eine positive Stoffbilanz

Temperatur

Im Gegensatz zu einer Enzymreaktion ist eine photochemische Reaktion (Lichtreaktion) weitgehend temperaturunabhängig (vergl. Photographie)

Im Schwachlicht wird die Intensität der Photosynthese durch die photochemischen Reaktionen begrenzt.

Im Starklicht: Q10 ca. 2, Optimumskurve, Hitzeschädigung durch Denaturierung, Optimum der meisten Pflanzen bei 20 - 30°C.

Folgerung: Die Photosynthese setzt sich aus einem lichtabhängigen (photochemischen) Reaktionskomplex (Lichtreaktion) und einer Folge von temperaturabhängigen, enzymatischen Reaktion (Dunkelreaktion) zusammen.

Zusammenfassung der bisherigen Erkenntnisse:

Aufgaben:

Bei sehr hoher Beleuchtungsstärke und sehr hoher Kohlenstoffdioxid-Konzentration nimmt die Photosynthese-Intensität wieder ab und geht im Extremfall sogar auf Null zurück. Erklärung?

 Lichtreaktionen

Pigmente der Photosynthese

Wirksamkeit verschiedener Spektralbereiche für die Photosynthese?

Engelmannscher Versuch: Fadenförmige Grünalgen, sauerstoffbedürftige Bakterien, Spektrum

Ansammlung der Bakterien an den Stellen mit größter Sauerstoffproduktion: Maximum im Rot und Blau, dazwischen weniger.

Strahlung kann nur wirksam werden, wenn die absorbiert wird.

Versuch: Chromatographie der Blattpigmente

1. Herstellung einer Rohchlorophylllösuung

Tiefgefrorener Spinat wird in einer Reibschale mit einer Sp Calciumcarbonat versetzt (zur Neutralisation der in den Blättern enthaltenen Säuren) und mit etwa der fünffachen Menge Aceton verrieben. Der Farbstoff-Extrakt wird in ein Rg abfiltriert, mit ca. 1 ml Petrolether versetzt und dann mit Wasser verdünnt. Man schüttelt gut durch (Überdruck!) und wartet, bis sich die Petroletherphase oben als dunkelgrüne Schicht abscheidet.

Nach dem gleichen Verfahren kann man frisches Blattmaterial (Blutbuche o.ä.) nach Zerreiben mit Sand extrahieren.

2. Dünnschichtchromatographie

Die Rohchlorophyllösung wird in einer Kapillare strichförmig auf der mit Bleistift markierten Startlinie aufgetragen (oder nach Eintauchen mit Aceton zur Startlinie hochsteigen lassen).

Entwicklung des Chromatogramms mit Petrolether/Aceton 3:1. Wegen Lichtempfindlichkeit der Farbstoffe starke Beleuchtung vermeiden. Nach dem Herausnehmen Frontlinie markieren und die Farbstoffbanden umranden (die Farben verblassen später größtenteils)

Ergebnis: ß-Carotin, Chlorophyll a (blaugrün), Chlorophyll b (gelbgrün), Xanthophylle

Chlorophyll a,b als wichtigstes Blattpigment

- Magnesium als Zentralatom

- Tetrapyrrol-Ringsystem mit konjugierten Doppelbindungen (Farbe!)

- hydrophile und lipophile Eigenschaften

- Fluoreszenz

Versuch: Fluoreszenzinduktion in vivo

Bestrahlung eines teilweise mit Schablone abgedeckten Blattes mit blauem Licht (CuSO4-Filter) bei verdunkeltem Raum, anschließend Betrachtung des Blattes nach Entfernung der Schablone durch ein Rotfilter.

Ergebnis: Die von der Schablone verdeckten Teile des Blattes leuchten hell auf (Fluoreszenz).

Deutung: Fällt Licht auf ein vorher abgedunkeltes Blatt, so benötigt der Photosynthesemechanismus einige Zeit, um in Gang zu kommen. So lange wird das eingestrahlte Licht nicht für die PS genutzt, sondern stattdessen als Fluoreszenzlicht abgestrahlt.

Photosynthetisch aktive Blätter zeigen nur geringe Fluoreszenz.

Zusatzversuche: Hitzedenaturierung

Absorptionsspektren der Blattpigmente und Vergleich mit dem Aktionsspektrum (=Wirkungsspektrum) der Photosynthese:

Welchen Beitrag liefert die Strahlungsabsorption der verschiedenen, im Photosyntheseapparat vorkommenden Pigmente zur Photosynthese?

Zur experimentellen Untersuchung dieser Frage mißt man die

O₂-Produktion bei Einstrahlung von Licht verschiedener Wellenlängen, aber gleicher Quantenstromdichte -> Aktionsspektrum (=Wirkungsspektrum) der Photosynthese:

blau           grün           orange         rot

Ergebnisse und Schlussfolgerungen aus dem Vergleich der verschiedenen Absorptions- und Aktionsspektren:

- Chlorophyll a und b besitzen ausgeprägte Absorptionsmaxima im Rot und Blau, dabei sind die Maxima bei Chlorophyll b so verschoben, dass dadurch die „Grünlücke“ verkleinert wird.

- Carotin schließt die Absorptionslücke des Chlorophylls teilweise.

- Das Aktionsspektrum folgt im wesentlichen dem Absorptionsspektrum der Blattpigmente Chlorophyll a, b und Carotin.

- Auch die vom Carotin absorbierte Strahlungsenergie wird für die Photosynthese genutzt, wenn auch mit etwas geringerem Wirkungsgrad.

Elektronentransport bei der Lichtreaktion

6 CO₂ + 12 H₂O -> C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ + 6 H₂O

Frage nach der Herkunft des Sauerstoffs

Bakterienphotosynthese (grüne Schwefelbakterien):

6 CO₂ + 12 H₂S -> C₆H₁₂O₆ + 12 S + 6 H₂O

Schwefelwasserstoff ist hier Wasserstoffdonator. In Analogie zur Bakterienphotosynthese müßte bei der Photosynthese der grünen Pflanzen Wasser als Wasserstoffdonator dienen.

Hill-Reaktion: Isolierte Chloroplasten entwickeln in Gegenwart reduzierbarer Substanzen Sauerstoff, auch ohne CO₂!

O-18-Tracermethode: Markierung des Wassers mit dem schweren Sauerstoffisotop O-18 -> Der gesamte O-18 erscheint als photosynthetisch entwickelter Sauerstoff, aber nicht im Kohlenhydrat:

6 CO₂ + 12 H₂¹⁸O -> C₆H₁₂O₆ + 6 ¹⁸O₂ + 6 H₂O

Ergebnis: Wasser spiet die Rolle eines Elektronendonators

Elektronenentzug aus dem Wasser wird ermöglicht durch Oxidations- und Reduktionsschritte an einem Chlorophyllmolekül (Reaktionszentrum)

         D    ->   P    ->   A    Lichtabsorption

         D    ->   P*   ->   A    Pigment im angeregten Zust.

         D    ->   P+ e ->   A-   Red. des Elektronenakzeptors

         D+ e ->   P    ->   A-   Ox. des Elektronendonators

e    ->   D    ->   P    ->   A    ->   e    Aufnahme und Agbabe von Elektronen, Wiederherstellung des Ausgangszustands

Photophosphorylierung

zyklische Photophosphorylierung

- Begleitet von einem zyklischen Elektronentransport um das Pigmentsystem I

- Die Elektronen werden vom Akzeptor des Pigmentsystems I nicht in Richtung auf NADP, sondern wieder zurück auf Plastochinon übertragen.

- Bei diesem zyklischen Kreislauf werden Protonen über das Plastochinon in das Thylakoidinnere abgegeben. Der so entstehende Protonengradient (pH-Gradient) stellt ein elektrochemisches Potential dar, das für die Synthese von ATP genutzt wird.

- Die zyklische Photophosphorylierung arbeitet unabhängig vom Pigmentsystem II und ist damit nicht mit einer Wasserspaltung verbunden.

nichtzyklische Photophosphorylierung

- Begleitet von einem linearen Elektronentransport, von Sauerstoffentwicklung und Reduktion von NADP

3 Teilreaktionen dieses Elektronentransports führen zum Aufbau eines Protonengradienten, der Energiequelle für die ATP-Synthese:

1. Protonenfreisetzung bei der Wasserspaltung an der Innenseite der Thylakoidmembran.

2. Bei der Reduktion des Elektronenüberträgers Plastochinon werden an der Außenseite des Thylakoids Protonen aufgenommen und an der Innenseite wieder freigesetzt.

3. Bei der Reduktion des NADP werden an der Außenseite des Thylakois Protonen aufgenommen.

Die eigentliche ATP-Synthese erfolgt nach heutuger Auffassung beim Ausgleich des Protonengradienten an einem Enzymsystem, der ATP-Synthetase, unabhängig und räumlich getrennt vom Pigmentsystem.

Dunkelreaktionen

CO2-Fixierung: Bindung an einen C5-Körper; Spaltung des C6-Körpers;

Reduktion: Reaktion von Glycerinsäure-3-phosphat zu Glycerinaldehyd-3-phosphat unter Verbrauch von ATP und NADH + H+;

Glucosebildung: Bildung des C6-Körpers und Rückbildung des CO2-Akzeptors (stark vereinfachte Darstellung); Erarbeiten der Bruttogleichung; Vorstellen der C-14-Tracermethode; Aufzeigen des Wirkungsgrades des Gesamtprozesses

Aufklärung der CO2-Reduktion mit Radiokohlenstoff (C-14-Tracermethode)

Frage: Über welche chemischen Reaktionen wird das CO2 gebunden und in Kohlenhydrat übergeführt?

Probleme:

- Unterscheidung der Verbindungen, die an der CO2-Reduktion beteiligt sind von solchen, die an den übrigen biochemischen Reaktionen beteiligt sind ist schwierig, da es sich zum Teil unm die gleichen Stoffe handelt

- viele Zwischenprodukte treten aufgrund ihrer schnellen Weiterverarbeitung nur spurenweise auf.

Prinzip der Tracermethode mit C-14

- Pflanzen (einzellige Grünalgen) werden kurzzeitig mit ¹⁴CO2 in Kontakt gebracht (zur Erfassung der Primärprodukte)

- Fixierung und Extraktion in siedendem Alkohol

- Auftrennung der gelösten Substanzen durch zweidimensionale Papierchromatographie

- Autoradiographie: Radioaktiv markierte Substanzen erzeugen auf Photopapier Schwärzungsflecke

- Identifizierung der radioaktiv markierten Substanzen durch Abbauversuche und Co-Chromatographie

Ergebnis:

3-Phosphoglycerinsäure als Primärprodukt

Ablauf der Dunkelreaktion - Calvincyclus

          CO₂-Akzeptor              Primärprodukt    Triose(KH)

Ribulose-1.5-biphhosphat    Glycerinsäure-3-phosphat   Glycerinaldehyd-3-phosphat

Regeneration des CO₂-Akzeptors durch den Calvin-Cyclus

Summengleichung der Dunkelreaktion:

6 CO₂ + 12 NADPH₂ + 18 ATP -> C₆H₁₂O₆ + 6 H₂O + 6 NADP +18(ADP+P)

Zusammenfassung der Licht- und Dunkelreaktion

Summengleichung für die Lichtreaktion

12     12         18       12         18       6

2 H₂O + 2 NADPH₂ + 3 ATP -> 2 NADPH₂ + 3 ATP +   O₂

Summengleichung der Dunkelreaktion:

6 CO₂ + 12 NADPH₂ + 18 ATP -> C₆H₁₂O₆ + 6 H₂O + 6 NADP +18(ADP+P)

Gesamtgleichung:

6 CO₂ + 12 H₂O -> C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ + 6 H₂O