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Aspekte der Gentechnologie
Gentechnik
– Begriff, Werkzeuge und Methoden
Fragen
zur Sicherheit und Ethik Gentechnik – Begriff, Werkzeuge und MethodenUniversalität des genetischen Codes! => DNA (Gene) zwischen den Organismen prinzipiell austauschbar, egal ob Bakterium, Pilz, Pflanze oder Tier – Möglichkeiten!? Was ist Gentechnik? Unter Gentechnik versteht man die Analyse und Neukombination von DNA Was Gentechnik nicht ist: Embryoteilung, Stammzellforschung und Embryotransfer - künstliche Befruchtung - Klonierung - klassische Züchtungsverfahren
Die wichtigsten
Werkzeuge der Gentechnik: Restriktionsenzyme – molekulare ScherenRestriktionsenzyme
schneiden die DNA an spezifischen Stellen, jeweils dort, wo 4 - 6 Basenpaare in
ganz bestimmter Folge vorliegen. In Bakterien dienen sie
als Schutz gegen Viren. Es entstehen
klar definierte Fragmente. Die Erkennungssequenzen weisen eine gegenläufig
gleiche Symmetrie auf, es sind sog. Palindrome. 2 Typen: Manche
Restriktionsenzyme schneiden versetzt, mit überstehenden einsträngigen Enden,
andere schneiden die DNA glatt durch. Beispiele:
Bei den versetzt
schneidenden Restriktionsenzymen entstehen kurze einsträngige überstehende
Enden. Diese sind zueinander komplementär und dadurch können sich alle Fragmente beliebig über Wasserstoffbrücken
verbinden (sog. kohäsive Enden oder „klebrigen Enden“ . Neu
gepaarte DNA-Stücke werden durch das Enzym Ligase kovalent verknüpft.
VektorenVektoren sind
Vehikel, mit deren Hilfe Fremd-DNA in eine Zelle eingeschleust werden kann.
Als Plasmide, Phagen oder Viren können sie sich in Zellen autonom replizieren
und bieten damit die Möglichkeit zur Klonierung rekombinanter DNA. Plasmide sind in Bakterien vorkommende, ringförmige DNA-Moleküle,
die zusätzlich zum eigentlichen Bakterienchromosom vorkommen können
und unabhängig vom übrigen Genom vermehrt werden. Plasmide können von einem Bakterium auf ein anderes übertragen werden. Sie tragen häufig
Gene für Resistenzen gegen Antibiotika und können dann einen Selektionsvorteil
bieten.
Das E.coli-Plasmid pBR 322 trägt Antibiotika-Resistenzgene für Ampicillin und Tetracyclin, die als Markergene dienen. „ori“ bezeichnet den Replikationsursprung. Als Werkzeug für die Gentechnik enthält es jeweils eine Schnittstelle für verschiedene Restriktionsenzyme.
Ringöffnung mit Hilfe eines bestimmten Restriktionsenzyms ermöglicht das Einfügen eines fremden Gens. Das Tetrazyklin-Resistenzgen wird durch den künstlichen Gen-Einschub inaktiviert. Da ein bestimmtes Restriktionsenzym jeweils nur auf eine einzige Erkennungsregion anspricht können Teilstücke verschiedenster Herkunft, sofern sie nur durch Behandlung mit diesem einen Enzym entstanden sind, miteinander vereinigt oder in Plasmide eingebaut werden.
Durch Einbau fremder DNA-Stücke in Plasmide erhält man Hybrid-Plasmide, die in Bakterienzellen vermehrt werden können (Klonierung) Plasmid-DNA mit Resistenzgenen kann in nicht resistente Bakterien eingeschleust werden (Aufnahme freier DNA durch die Zellwand = Transformation).
Da sich die Bakterien mit dem
aufgenommenen DNA-Stück identisch replizieren, kann man so Millionen Kopien des
Resistenzplasmids erzeugen (Klonierung). Selektion mit Hilfe der Stempeltechnik
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)Mit Hilfe der
Polymerase-Ketten-Reaktion (Polymerase chain reaction = PCR) kann man in
ein paar Stunden millionenfach Kopien von bestimmten DNA-Segmenten erzeugen. Die PCR Methode ist eine zyklische Reaktion, bei der ein DNA-Strang 30 Sekunden bei 90-95 °C hitzedenaturiert wird, um beide Stränge voneinander zu trennen. Dann wird auf 55°C abgekühlt und ein Primer (20-30 Basen), komplementär zum gewünschten DNA-Abschnitt angebracht. Der Zyklus endet mit der Verlängerung durch eine hitzestabile Taq DNA- Polymerase ( aus Thermus aquaticus, einem thermophilen Bakterium aus heißen Quellen des Yellowstone National Parks) bei 75°C, wobei identische Kopien produziert werden. Der ganze Vorgang kann bis zu 30 Mal wiederholt werden, wird heute in speziellen Maschinen durchgeführt und liefert dabei in ca. 3 Stunden 1 Million DNA-Kopien.
Sequenzanalyse der DNA
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