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2 Molekulargenetik

2.1 Nukleinsäuren als Speicher der genetischen Information

2.1.1 Watson-Crick-Modell der DNS

2.1.2 semikonservativer Replikationsmechanismus

2.2 molekulare Wirkungsweise der Gene

2.2.1 Bauprinzip und Bedeutung der Proteine

2.2.2 genetischer Code und Proteinbiosynthese

2.2.3 Ursachen und Folgen von Genmutationen

2.3 Aspekte der Gentechnologie

2.3.1 künstliche Neukombination genetischer Information bei Bakterien

2.3.2 Anwendungsmöglichkeiten bei Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren

2.3.3 Gendiagnostik und Eingriffe in den Genbestand beim Menschen  

Nukleinsäuren als Speicher der genetischen Information

Die Experimente von GRIFFITH und AVERY

Versuch von GRIFFITH (1928)

Untersuchung der Pathogenität von Pneumokokkenstämmen

Ergebnis: Die Fähigkeit zur Kapselbildung war von den toten S- auf die lebenden R-Zellen übertragen worden und wurde auch an die Nachkommen weitergegeben.

AVERY u.a. (1944) erhielten nach Reinigung des übertragenen Faktors zu 99% DNA

ð     DNA ist der Träger der genetischen Information

Transformation: Übertragung von Erbinformation in Form reiner DNA

Watson-Crick-Modell der DNS

Aufklärung durch Röntgenstrukturanalyse

Bausteine:

Zucker Desoxyribose

Phosphorsäure

4 Basen: Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin

Basenpaarung:

A=T   GºC

- Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin sind komplementäre Basen

- Zusammenhalt über Wasserstoffbrückenbindungen

Nucleotide als Bausteine: Base-Pentose-Phosphorsäure

Schema:

Primärstruktur: spezifische Basenfolge (Information!)

Sekundärstruktur: Doppelhelix

Zusammenhalt über Wasserstoffbrückenbindungen ermöglicht Auseinanderweichen ohne größeren Energieaufwand (Voraussetzung für Replikation, Transkription) - Entwindung notwendig -

Spezifität der Basenpaarung

Voraussetzung für Kopiergenauigkeit bei der Replikation und Transkription

Unterschiede zwischen DNA und RNA

- RNA fast immer in Einstrangform

- Zuckerbaustein Ribose statt Desoxyribose

- Base Uracil statt Thymin

semikonservativer Replikationsmechanismus

Hypothesen über den Mechanismus der DNA-Replikation:

1. Der DNA-Doppelstrang entspiralisiert sich, bleibt aber als Ganzes erhalten und bildet in dieser Form die Matritze für die Verdopplung.

Ergebnis: unveränderter Mutterdoppelstrang und neu synthetisierter Tochterstrang = konservativer Mechanismus:

2. Die beiden Schwesterstränge trennen sich, jeder von ihnen dient als Matritze für die Neusynthese eines Komplementärstrangs = semikonservativer Mechanismus:

Versuch von MESELSON und STAHL

Sie züchteten E.coli-Zellen während zahlreicher aufeinanderfolgender Generationen auf einem Medium mit N-15-haltigen Salzen als einziger Stickstoffquelle: Markierung aller DNA-Moleküle mit N-15.

Verdünnung der Zellsuspension auf 100 mit N-14-haltigem Nährmedium - daher fortan nur noch Einbau von N-14 in neu synthetisierte DNA-Moleküle.

Probenentnahme in bestimmten Zeitabständen und Trennung der DNA durch Zentrifugieren im Dichtegradienten.

Ergebnis:

Deutung:

Die beiden Schwesterstränge trennen sich, jeder von ihnen dient als Matrize für die Neusynthese eines Komplementärstrangs = semikonservativer Mechanismus

Versuch: DNA-Extraktion aus Bananen 

(nach Lit.: http://www.gingko-web.de/anreg/versuche/dna_prep.htm)

Diese vereinfachte Methode (als Schülerversuch geeignet) zeigt das Grundprinzip der DNA-Extraktion aus Geweben auf:

• mechanische Zerkleinerung des Gewebes
• Auflösung der Zell- und Kernmembranen durch ein Tensid
• Abtrennung der Zelltrümmer
• Fällung der Nucleinsäuren

Durchführung (leicht verändert)

1/4 Banane in einem Porzellanmörser mit Pistill zu einem feinen Brei zerdrücken, 30 ml Extraktionspuffer zufügen, vermischen und noch mindestens 5 min mit Pistill verreiben, anschließend Filtration durch ein Kaffeefilter (kein Laborfilter!) in ein Reagenzglas filtrieren. Man beachte die hohe Viskosität der Flüssigkeit. Filtrat mit der gleichen Menge eiskaltem Spiritus überschichten und langsam mit einem Glasstab oder Holzstäbchen vermischen. Ausfällung der DNA beobachten. Die unlösliche DNA kann am Holzstäbchen als Klumpen herausgezogen werden.

Extraktionspuffer-Rezeptur:

8,8 g Natriumcitrat-dihydrat

1,8 g Natriumchlorid (Kochsalz)

5 g Natrium-dodecylsulfat (Vorschrift: 20 ml Spülmittel)

mit Wasser auf 200 ml auffüllen

molekulare Wirkungsweise der Gene

Bauprinzip und Bedeutung der Proteine  

Einführungsgedanken:

- Proteine als stoffliche Träger des Lebens (Nucleinsäuren: Vererbung, Plan - Proteine: Ausführung)

- Beispiele für die Vielfalt der Proteine: kontraktile Eiweiße in Muskeln - Kollagenfasern in Sehnen und Bindegewebe - Hämoglobin mit Transportfunktion - Enzyme - Antikörper usw.

Bei der Hydrolyse der verschiedensten Proteine wurden 20 Aminosäuren als Bausteine entdeckt. 

allgemeine Formel:

Die einzelnen Aminosäuren unterscheiden sich durch die verschiedenen Reste R.

Nach unterschiedlichen Seitengruppen kann man die Aminosäuren in 4 Gruppen einteilen:

- Aminosäuren mit unpolaren Seitengruppen

- Aminosäuren mit polaren, aber ungeladenen Seitengruppen

- Aminosäuren mit basischen Seitengruppen

- Aminosäuren mit sauren Seitengruppen

Aminosäuren

Glycin	Alanin	Valin	Leucin	Isoleucin
unpolare Seitengruppe
Methionin	Phenylalanin	Tryptophan	Prolin
Serin	Threonin	Cystein	Tyrosin	Asparagin	Glutamin
polare, ungeladene Seitengruppe
Lysin	Arginin	Histidin	Asparaginsäure	Glutaminsäure
basische Seitenkette			saure Seitenkette

Einige Aminosäuren (Valin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin und Threonin) kann der Mensch nicht selbst synthetisieren, er muss sie mit der Nahrung aufnehmen. Man bezeichnet diese als essentielle Aminosäuren.

Bedeutung der essentiellen Aminosäuren für das Welternährungsproblem, Pflanzenzüchtung (lysinhaltiger Weizen), Wertigkeit des Eiweißes, Eiweißminimum)

Mit Ausnahme von Glycin (=Aminoethansäure), wo R = Wasserstoff ist, tragen alle Aminosäuren am a-C-Atom ein Chiralitätszentrum und sind somit optisch aktiv:

Als Bausteine von Proteinen treten nur L-Aminosäuren auf. 

Peptidbindung  

Verknüpfung der Aminosäurebausteine in Peptiden und Proteinen:

Die  Carboxlgruppe einer Aminosäure reagiert mit der Aminogruppe einer anderen Aminosäure unter Wasserabspaltung (= Kondensation). Ergebnis: Peptidbindung (entspricht der Bildung eines Säureamids).

Bildung eines Dipeptids aus zwei Aminosäuren:

Durch Verknüpfung mit weiteren Aminosäuren entstehen aus dem Dipeptid ein Tripeptid, Tetrapeptid usw., schließlich Polypeptide und Proteine.

2 - 10 Aminosäuren: Oligopeptid

11 - 100 Aminosäuren: Polypeptid

> 100 Aminosäuren: Protein

Richtung der Aminosäurekette: Aminoanfang und Carboxylende

In Umkehrung ihrer Bildung können Peptidbindungen durch Hydrolyse säurekatalytisch oder enzymatisch gespalten werden (vergl. Esterbindung).

Struktur der Proteine  

Primärstruktur: Reihenfolge der Aminosäuren in einem Protein (= Aminosäure-Sequenz)

z.B.: ...-Gly-Leu-Tyr-Ala-Pro-His-...

Jedes Protein hat eine genetisch streng festgelegte Aminosäuresequenz. Bereits geringfügige Abweichungen davon können zum Verlust der biologischen Aktivität führen.

Anzahl möglicher Proteine? 20¹⁰⁰ !!!

Frage nach der räumlichen Anordnung der Aminosäurekette (Konformation): Zufälliges Knäuel (random coil) oder ganz bestimmte, für die Funktion wichtige Anordnung?

Welche Kräfte werden zwischen den Kettengliedern wirksam?

- Kovalente Bindung (Disulfidbrücken)

- Wasserstoffbrückenbindung

- Ionenbindung

- hydrophobe Bindung

Sekundärstruktur: Raumanordnung eines Proteins in Form einer a-Helix oder Faltblattstruktur durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Peptidbindungen

(R-C=O...H-N-R´)

a-Helix

intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den CO- und NH-Gruppen der Peptidbindungen stabilisieren die Struktur einer Rechtsschraube. Die Seitenketten der AS-Reste sind nach außen gerichtet. (Beispiel: Keratin):

Faltblattstruktur

Zwei gestreckte AS-Ketten liegen antiparallel zueinander. Dadurch wird die Bildung intermolekularer

(= zwischenmolekularer) Wasserstoffbrücken zwischen NH- und CO-Gruppen der Peptidbindungen möglich (Beispiel: Seide).

Tertiärstruktur: Räumliche Anordnung der Sekundärstruktur (Windungen und Faltungen der -Helix). Sie wird bestimmt von den Wechselwirkungen der Aminosäure-Seitenketten.

Beispiel: Tertiärstruktur des Myoglobins

Dauerwellen: Lösen der Disulfidbrücken und Neuverknüpfung

Trotz vieler theoretisch möglicher Tertiärstrukturen eines Proteins ist die biologische Wirksamkeit an eine ganz bestimmte Tertiärstrtuktur gebunden - Entstehung? -

Quartärstruktur: Aufbau manchen Proteine aus mehreren Untereinheiten

(liegt fast immer vor, wenn ein Protein aus > 200 AS-Bausteine besteht)

Beispiel: Hämoglobin aus 4 Untereinheiten:

Denaturierung (Strukturveränderung des Proteins unter Verlust der biologischen Wirksamkeit) durch Hitze, Schwermetalle, Säuren, organische Lösungsmittel

Genetischer Code und Proteinbiosynthese: Transkription, Translation

Bedeutung der Aminosäuresequenz für die Funktion eines bestimmten Proteins (Beispiel: Sichelzellenanämie GluàVal) - Ursache: Gen-Defekt, Mutation

Ein-Gen-ein-Polypeptid-Hypothese: Ein Gen ist zuständig für den Aufbau eines ganz bestimmten Polypeptids.

Zentrales Dogma der Molekularbiologie:

Transkription

Transkription: Übertragung genetischer Information von der DNA auf Moleküle der Boten-RNA (m-RNA, messenger-RNA)

Wiederholung.: Unterschied DNA-RNA

Vereinfachte Darstellung:

Fragen:

- welcher Abschnitt der DNA soll transkribiert werden und wie oft?

- welcher der beiden Einzelstränge und in welcher Richtung?

Promotor: Startpunkt der Transkription auf der DNA, Bindungsstelle für das Enzym RNA-Polymerase

Durch Basenpaarung mit dem codogenen Strang der DNA werden in diesem Bereich komplementäre RNA-Nucleotide gebunden und mit der wachsenden RNA-Kette verknüpft.

codogener Strang: der Strang der DNA, der als Matritze dient

Stoppsignal auf der DNA beendet die Transkription

Genetischer Code

Grundsätzliche Überlegungen:

Basensequenz der m-RNA legt die Aminosäuresequenz des Proteins fest.

4 Basen für 20 Aminosäuren

Zweiergruppe von Basen à 4² => 16 AS max. möglich

Dreiergruppe von Basen à 4³ => 64 AS max. möglich!

Aufklärung des genetischen Code

Zellfreie Systeme! (Ribosomen, Boten-RNA, 20 verschiedene Aminosäuren, 61 verschiedene t-RNA, 61 verschiedene Synthetasen, ATP-regenerierendes System, GTP(=“Ribosomenmotor“), Mg²⁺(=“Ribosomenkitt“)

1. künstliche RNA (NIRENBERG, OCHOA, 1961)

UUUUUUUUUU... à Poly-Phe à Phe

AAAAAAAAAA... à Poly-Lys à Lys

CCCCCCCCCC... à Poly-Pro à Pro

2. (NIRENBERG, LEDER, 1965) Synthetische Trinucleotide bekannter Basensequenz als Boten-RNA an Ribosomen fixiert + alle mit AS beladenen t-RNA-Typen, eine davon von Versuch zu Versuch war radioaktiv markiert à nur eine bestimmte AS wurde gebunden.

3. (KHORANA) Proteinsynthese an zuvor synthetisch hergestellten Boten-RNA-molekülen genau definierter Zusammensetzung

XYXYXYXYXY... à ababab...

XYZXYZXYZXYZ... à aaaaaaaaa...

YZXYZXYZXYZ... à bbbbbbbbbb...

ZXYZXYZXYZ... à cccccccccc...

Zusammenfassung:

• Die Basensequenz der DNA determiniert die komplementäre Basensequenz der Boten-RNA und diese die Aminosäuresequenz im Protein.

• Der genetische Code (Übersetzungsschlüssel) besteht aus Codonen (Informationselementen) zu je drei Nucleotiden (Tripletts), die kommafrei durch Abzählen von einem Startcodon gelesen und in je eine Aminosäure übersetzt werden.

• Von den 64 Tripletts codieren 61 für die 20 Aminosäuren, d.h. der genetische Code ist redundant (degeneriert). Häufig ist die dritte Position im Triplett unwesentlich.

• UAA, UAG und UGA codieren für keine Aminosäure und führen zum Kettenabbruch.

• Der genetische Code hat bei (nahezu) allen Lebewesen die gleiche Bedeutung, er ist universell.

Bestätigung des genetischen Codes an Hämoglobin-Mutanten

HbA  Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser-

HbS  Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser-

Translationsvorgang am Ribosom

Kleeblattstruktur der t-RNA am Beispiel der t-RNA der Hefe für Alanin: 

Beladung der t-RNA mit Aminosäuren

• Aktivierung der Aminosäuren durch ATP mittels aminosäure-spezifischer Enzyme (Synthetasen).

• Koppelung der aktivierten Aminosäure an eine t-RNA mit spezifischer Tertiärstruktur und spezifischem Basentriplett (Anticodon) mittels des spezifischen Enzyms.

Startsignal eines Poteinmoleküls: In der Bakterienzelle hat Formylmethionin (AUG,GUG) die Aufgabe des Anfangssignals für die Synthese eines Proteinmoleküls.

Polypeptid-Bildung

1. Bildung eines Startkomplexes aus m-RNA, Ribosom und Formylmethionin-t-RNA

2. Wenn am Akzeptor-Ort des Ribosoms ein freies Codon der m-RNA erscheint, wird eine beladene t-RNA mit passendem Anticodon gebunden.  

3. Peptidverknüpfung! (die erforderlichen Enzyme sind an die Ribosomenstruktur gebunden)

4. Ablösung der leeren t-RNA und Verschiebung um die Länge eines Codons (ein neuer Akzeptor-Ort wird frei), weiter bei 2.

Störungen der Proteinsynthese durch Antibiotika wie Puromycin, Streptomycin.

Proteinbiosynthese bei Eukaryonten - Unterschiede

Vergleich: Radiosendung mit Musikpausen - Musik herausschneiden

Biologischer Sinn der Introns?

- Genaustausch erleichtert - es muss nicht exakt geschnitten werden

- Spielwiese der Evolution?

- aus einem Gen können durch differentielle Prozessierung verschiedene Proteine hergestellt werden (100 versch. Proteine aus einem Gen!)

Ursachen und Folgen von Genmutationen

Genommutationen = numerische Chromosomenaberrationen: Anzahl der Chromosomen vermehrt oder vermindert

Heteroploidie: einzelne Chromosomen vermehrt oder vermindert (z.B. Trisomie 21)

Polyploidie: der vollständige haploide Chromosomensatz ist mehr als zweimal vorhanden

Chromosomenmutationen = Strukturaberrationen: Chromosomenbruchstücke gehen verloren oder werden falsch angeheftet

Genmutationen: nicht sichtbare Veränderungen an Chromosomen, nur ein Gen betroffen (Punktmutationen und Rastermutationen)

Beispiel: Phenylketonurie

Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese: Ein Gen codiert für die Synthese eines Enzyms, das seinerseits einen bestimmten Stoffwechselschritt katalysiert. 

Mutationsauslösung

• Strahlung (UV, ionisierende Strahlung)

• mutagene Chemikalien  

• spontane Mutationen  

Tautomerie der Basen als Ursache für spontane Mutationen: Thymin liegt normalerweise in der Keto-Form vor und paart sich dann mit Adenin. In der seltenen Enol-Form paart sich Thymin mit Guanin statt mit Adenin.

Wirkung von Acridin-Farbstoffen:

Aufgaben

Lösungen zu den Aufgaben 1 - 5

1. Um welche Art von Verbindung handelt es sich bei der dargestellten Strukturformel? Aus wie vielen Bausteinen ist das Molekül aufgebaut und wie lautet die allgemeine Bezeichnung für diese Bausteine? Kennzeichnen Sie die Verknüpfungsstellen in der dargestellten Strukturformel durch eine Trennungslinie.  

2. Gegeben ist die Basensequenz der folgenden Boten-RNA:

GCCUAACUAGGUACC

Schreiben Sie die Basensequenz der DNA auf, aus der diese m-RNA-Sequenz hervorgegangen ist und kennzeichnen Sie dabei den codogenen Strang.

3. Eine künstlich hergestellte Boten-RNA mit der folgenden Sequenz wird in Protein übersetzt:

CCCACCCACCCACCCACCCACCCA...

Welche Sequenz weist das daraus entstehende Protein auf? (Verwenden Sie die im genetischen Code angegebenen Kurzbezeichnungen)

4. Führt der Austausch eines (komplementären) Basenpaares in der DNA gegen ein anderes Basenpaar in jedem Fall zu einem Protein mit veränderter Struktur? (Die Antwort ist zu begründen)

5. Bewerten Sie die folgenden Veränderungen auf dem codogenen Strang der DNA (Mutationen) im Hinblick auf den Schweregrad der möglichen Auswirkung und begründen Sie Ihre Antwort:

a) Einfügen einer zusätzlichen Base

b) Verlust einer Base

c) Austausch einer Base gegen eine andere

d) Verlust dreier Basen  

Lösungen zu 1 - 5

1. (Oligo-)Peptid - 3 Aminosäuren

2.

GCC TAA CTA GGT ACC

CGG ATT GAT CCA TGG codogener Strang

3. Pro-Thr-His-Pro-Pro-Thr-His-Pro

4. Nein, der genet. Code ist redundant, eine verändete Basensequenz könnte für die gleiche Aminosäure codieren

5. a) schwerwiegend - Verschiebung des Leserasters - alle nachfolgenden Codons verändert - viele falsche AS, evtl. Stoppcodons b) wie bei a);  c) meist weniger schwerwiegend - es kann eine falsche Aminosäure anstelle einer richtigen eingebaut werden, alle weiteren richtig, evtl auch Stoppcodon d) meist weniger schwerwiegend - Ausfall einer Aminosäure, aber keine Rasterverschiebung