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 Aminocarbonsäuren und Proteine

Aminocarbonsäuren: Molekülstruktur, Eigenschaften (7h)

Einführungsgedanken:

- Proteine als stoffliche Träger des Lebens (Nucleinsäuren: Vererbung, Plan - Proteine: Ausführung

- Vielfalt der Proteine: kontraktile Eiweiße in Muskeln - Kollagenfasern in Sehnen und Bindegewebe - Hämoglobin mit Transportfunktion - Enzyme - Antikörper usw.

Bei der Hydrolyse der verschiedensten Proteine wurden 20 Aminosäuren als Bausteine entdeckt. 

allgemeine Formel:

alle in Proteinen vorkommenden Aminosäuren sind a-Aminosäuren, d.h. sie tragen eine Aminogruppe in a-Stellung zur Carboxylgruppe.

Die einzelnen Aminosäuren unterscheiden sich durch die verschiedenen Reste R.

Nach unterschiedlichen Seitengruppen kann man die Aminosäuren in 4 Gruppen einteilen:

- Aminosäuren mit unpolaren Seitengruppen

- Aminosäuren mit polaren, aber ungeladenen Seitengruppen

- Aminosäuren mit basischen Seitengruppen

- Aminosäuren mit sauren Seitengruppen

Aminosäuren

Glycin	Alanin	Valin	Leucin	Isoleucin
unpolare Seitengruppe
Methionin	Phenylalanin	Tryptophan	Prolin
Serin	Threonin	Cystein	Tyrosin	Asparagin	Glutamin
polare, ungeladene Seitengruppe
Lysin	Arginin	Histidin	Asparaginsäure	Glutaminsäure
basische Seitenkette			saure Seitenkette

Einige Aminosäuren (Valin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin und Threonin) kann der Mensch nicht selbst synthetisieren, er muss sie mit der Nahrung aufnehmen. Man bezeichnet diese als essentielle Aminosäuren.

Bedeutung der essentiellen Aminosäuren für das Welternährungsproblem, Pflanzenzüchtung (lysinhaltiger Weizen), Wertigkeit des Eiweißes, Eiweißminimum)

Mit Ausnahme von Glycin (=Aminoethansäure), wo R = Wasserstoff ist, tragen alle Aminosäuren am a-C-Atom ein Chiralitätszentrum und sind somit optisch aktiv:

D-(+)-Glycerinaldehyd als Bezugssubstanz	D(-)-Alanin  L(+)-Alanin

Als Bausteine von Proteinen treten nur L-Aminosäuren auf. Außerhalb von Proteinen werden vereinzelt auch D-Aminosäuren gefunden.

Aminosäuren zeigen hinsichtlich Schmelzpunkt und Löslichkeit gewisse Ähnlichkeit mit Salzen (Versuche)

- hoher Schmelzpunkt, bei ca. 300°C (unter Zersetzung)

- bessere Löslichkeit in Wasser als in organischen Lösungsmitteln, sogar, wenn es sich bei R um eine hydrophobe Gruppe handelt

- starker Dipolcharakter

Die bisherige Formulierung der Aminosäuren war nicht exakt. Sie liegen bei neutralem pH als Zwitterion und nicht als ungeladenes Molekül vor:

Kation		Zwitterion		Anion
bei Säurezugabe Wanderung zur Kathode		beim isoelektrischen Punkt: Zahl der positiven und negativen Ladungen gleich - keine Wanderung im elektrischen Feld		bei Laugenzugabe Wanderung zur Anode

Aminosäuren haben schwach sauren Charakter (ca. pH 6): Der saure Einfluss der Carboxylgruppe überwiegt.

Aminosäuren sind Ampholyte, d.h. sie bilden mit Säuren und Laugen Salze.

Pufferwirkung!

Aminosäuren - Neutralisationskurve, Pufferwirkung

Versuch: Aufnahme der Neutralisationskurve einer Aminosäure:

89 mg (= 1 mmol) Alanin, gelöst in 100 ml HCl (c = 0.01 mol/l) mit NaOH (c = 0.1 mol/l) titrieren. pH-Werte im Abstand von 0,5ml Laugenzugabe messen. Erstellung des Graphen mit Computerunterstützung oder Wertetabelle - Eintrag auf Millimeterpapier - Wendepunkte kennzeichnen.

Erklärung, Grundlagen

Hensderson-Hasselbach-Gleichung:

wenn c(A^-) = c(HA) wird pH = pK_s => Halbtitration zur Bestimmung des pKs-Wertes   

Folgerung aus der Gleichung:

In einer Aminosäurelösung, deren pH-Wert den pKs-Werten entspricht, liegen jeweils äquimolare Mengen der beteiligten Dissoziationsstufen vor.

Versuch: pH-Abhängigkeit der Löslichkeit von Tyrosin

Durchführung: In ein Rggl gibt man 1 cm hoch Tyrosin-Suspension und versetzt so lange unter Schütteln tropfenweise mit verd. Natronlauge, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Zugabe etwa der gleichen Tropfenzahl verd. Salzsäure tritt eine weiße Trübung auf, die sich bei weiterer Zugabe von Säure wieder löst.

Erläuterung: Fast alle freien Aminosäuren sind aufgrund ihrer geringen Molekülgröße und ihrer Zwitterionenstruktur in Wasser gut löslich. Nur die wenigen, die einen ausgesprochen lipophilen Rest tragen, sind schwer löslich. Hierzu gehört die Aminosäure Tyrosin. Beim IP dominiert der lipophile Phenylrest des Tyrosins über die hydrophilen Gruppen des Zwitterions: die Aminosäure ist schwer wasserlöslich. Sobald der pH-Wert durch Säure- oder Basenzugabe verändert wird. geht die Aminosäure als Kation oder Anion in Lösung.

Nachweis von Aminosäuren: Ninhydrin-Reaktion

Durchführung:

Filtrierpapier mit Aminosäurelösungen beschreiben und danach auf eine heiße Kochplatte legen, bis zum Auftreten einer deutlichen blauen bzw. violetten Färbung.

Erläuterung: die Ninhydrinreaktion ist ein sehr empfindlicher und spezifischer Nachweis und wird bei der Identifizierung von Aminosäuren häufig angewandt.

Peptidbindung

Verknüpfung der Aminosäurebausteine in Peptiden und Proteinen:

Die  a-Carboxlgruppe einer Aminosäure reagiert mit der a-Aminogruppe einer anderen Aminosäure endergonisch unter Wasserabspaltung (= Kondensation). Ergebnis: Peptidbindung (entspricht der Bildung eines Säureamids).

Bildung eines Dipeptids aus zwei Aminosäuren:

Durch Verknüpfung mit weiteren Aminosäuren entstehen aus dem Dipeptid ein Tripeptid, Tetrapeptid usw., schließlich Polypeptide und Proteine.

2 - 10 Aminosäuren: Oligopeptid

11 - 100 Aminosäuren: Polypeptid

> 100 Aminosäuren: Protein

Übung: Dipeptid aus Ala und Cys (2 Möglichkeiten!)

Richtung der Aminosäurekette: Aminoanfang und Carboxylende

In Umkehrung ihrer Bildung können Peptidbindungen durch Hydrolyse säurekatalytisch gespalten werden (vergl. Esterbindung).

Resonanzstabilisierung - starrer planarer Bau im Bereich der CO-NH-Bindung (nur dann ist Überlappung der p-Orbitale möglich)

Nachweis von Peptidbindungen durch die Biuretprobe

Versuch:

1. Ca. 2 ml Proteinlösung mit einigen Tropfen Kupfersulfatlösung und der gleichen Menge verd. Natronlauge versetzen, schütteln.

Die Lösung färbt sich bei Anwesenheit von Proteinen violett (geht nicht mit Dipeptiden und Aminosäuren)

2. Biuret entsteht auch durch trockenes Erhitzen von Harnstoff über den Schmelzpunkt unter Abspaltung von Ammoniak:

Harnstoff            Biuret

Biuret-Komplex  

Proteine: Bauprinzip, Eigenschaften, Bedeutung (8h)

Struktur der Proteine  

Primärstruktur: Reihenfolge der Aminosäuren in einem Protein (= Aminosäuresequenz)

z.B.: ...-Gly-Leu-Tyr-Ala-Pro-His-...

Jedes Protein hat eine genetisch streng festgelegte Aminosäuresequenz. Bereits geringfügige Abweichungen davon können zum Verlust der biologischen Aktivität führen.

Anzahl möglicher Proteine? 20¹⁰⁰ !!!

Sequenzanalyse Aufklärung der Primärstruktur:

Insulin 1953 (Sanger)

1. Spaltung des Proteins in definierte Peptid-Bruchstücke mit überlappenden Sequenzen (Trypsin spaltet nach basischen Aminosäuren, Pepsin nach aromatischen Aminosäuren)

2. Sequenzanalyse der Peptid-Bruchstücke durch schrittweisen Abbau (z.B. mit Phenylsenföl -> PTH-AS)

3. Anhand überlappender Sequenzen wird die Verknüpfung der Peptidbruchstücke ermittelt.

Beispiel (FOLIE)

Enzym 1 liefert  AMINOS      ÄURES      EQUENZANALYS E

Enzym 2 liefert  AMI      NOSÄURESEQUE      NZA      NALYSE

A M I N O S Ä U R E S E Q U E N Z A N A L Y S E

Frage nach der räumlichen Anordnung der Aminosäurekette (Konformation): Zufälliges Knäuel (random coil) oder ganz bestimmte, für die Funktion wichtige Anordnung?

Welche Kräfte werden zwischen den Kettengliedern wirksam?

- Kovalente Bindung (Disulfidbrücken)

- Wasserstoffbrückenbindung

- Ionenbindung

- hydrophobe Bindung

Sekundärstruktur: Raumanordnung eines Proteins in Form einer a-Helix oder Faltblattstruktur durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Peptidbindungen

(R-C=O...H-N-R´)

a-Helix

intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den CO- und NH-Gruppen der Peptidbindungen stabilisieren die Struktur einer Rechtsschraube. Die Seitenketten der AS-Reste sind nach außen gerichtet. (Beispiel: Keratin):

Faltblattstruktur

Zwei gestreckte AS-Ketten liegen antiparallel zueinander. Dadurch wird die Bildung intermolekularer

(= zwischenmolekularer) Wasserstoffbrücken zwischen NH- und CO-Gruppen der Peptidbindungen möglich (Beispiel: Seide).

Tertiärstruktur: Räumliche Anordnung der Sekundärstruktur (Windungen und Faltungen der a-Helix). Sie wird bestimmt von den Wechselwirkungen der Aminosäure-Seitenketten 

Beispiel: Tertiärstruktur des Myoglobins

Dauerwellen: Lösen der Disulfidbrücken und Neuverknüpfung

Trotz vieler theoretisch möglicher Tertiärstrukturen eines Proteins ist die biologische Wirksamkeit an eine ganz bestimmte Tertiärstrtuktur gebunden - Entstehung? -

Quartärstruktur: Aufbau mancher Proteine aus mehreren Untereinheiten

(Fast immer, wenn MG über 50000 - ca. 200 AS))

Beispiel: Hämoglobin aus 4 Untereinheiten:

Methoden der Proteinchemie

 Elektrophorese

Prinzip: Geladene Teilchen wandern im elektrischen Feld in Richtung auf die entgegengesetzt geladene Elektrode.

Die Charakterisierung und Trennung von Proteinen aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladung im elektrischen Feld ist eine der wichtigsten Methoden der Proteinchemie.

Die Ladung der Proteinmoleküle hängt vom pH-Wert der Lösung ab. Deshalb muss die Elektrophorese in einer gepufferten Lösung durchgeführt werden. Durch Aufsaugen der zu untersuchenden Lösung in einem porösen Träger (z.B. Fitrierpapier, Gel) wird verhindert, dass sich die Proteinzonen vermischen.

Versuch: Wir beobachten die Wanderung von Albumin (aus Hühnerei). zur Albuminlösung wurde vorher eine kleine Menge Bromphenolblau gegeben. Dieses wird als blaues Kation vom Albumin absorbiert und man kann so das Wandern der Albuminbande beobachten.

Fragen:

- Welche Molekülgruppen sind für die bei pH 8,6 beobachtete Wanderungsrichtung verantwortlich?

- Sind zwei Stoffe in jedem Fall identisch, wenn sie die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit aufweisen?

- Wie könnte man den isoelektrischen Punkt eines Proteins bestimmen?

Denaturierung *)

Unter Denaturierung versteht man die Strukturänderrung eines Proteins, bei der die biologische Wirksamkeit weitgehend verloren geht, die Löslichkeit stark verringert wird und Veränderungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften zu beobachten sind.

Sie entspricht dem Übergang von einem hochgeordneten (unwahrscheinlichen) in einen weniger geordneten (wahrscheinlicheren) Zustand (=positive Entropieänderung)

Je nach den Bedingungen kann die Denaturierung reversibel oder irreversibel sein.

Versuche:

Hitze

Hühnereiklar erhitzen / irreversibel

Verdaulichkeit von Eiweiß roh oder gekocht besser?

Anwendung beim Sterilisieren, Konservieren, Einwecken, Fieber

Säuren

Hühnereiklar mit ver. Salpetersäure versetzen / irreversibel

konservierende Wirkung von Säuren (saure Gurken, Sauerkraut, saure Heringe, Silofutter, Joghurt) Gerinnung von saurer Milch

Ursache: Ladungsänderungen an Aminosäureresten verändern die Tertiärstruktur (Beispiel)

Aussalzen

Hühnereiklar mit konz. Ammoniumsulfatlösung versetzen: reversible Fällung (löst sich wieder bei Wasserzugabe)

Anwendung:

Proteinfällung in der Biochemie (Fraktionierung) konservierende Wirkung von Salz

Ursache: Konkurrenz der Salz-Ionen um die Wassermoleküle

Schwermetalle

Hühnereiklar mit Kupfersulfatlösung versetzen / irreversibel

Reaktion mit SH-Gruppen (vergl. Silberlöffel, Bleifarben)

Giftwirkung der Schwermetalle (Symptome, Beispiele) Blei, Quecksilber, Cadmium, Kupfer

Batterien, Klärschlamm, Quecksilberthermometer

organische Lösungsmittel

Aceton, Alkohol / nur teilweise reversibel

Desinfektion, konservierende Wirkung

Aufgaben: Aminosäuren und Proteine

Abituraufgaben Bayern

1994 IV 2 Aminosäuren; Zwitterion, Anion, Kation; IEP; KS und KB-Wert

1995 I 3 Ala, Asp, IEP-Zuordnung, Elektrophorese, Tripeptide (Isomere, Struktur)

1996 I 3 Glycin-Titrationskurve, Strukturformeln bei versch. pH, K_S- und K_B-Wert, IEP, Pufferbereich

1996 III 3.4 Aspartam Strukturformel

1997 II 3 Glycopeptid aus Phe-Ser-Ala und ß-D-Galactopyranose, Fehling u. Biuretprobe

1997 III 2 Elektrophorese Ala Glu Lys; IEP, Löslichkeit beim IEP

1998 IV 2.3 Tripeptid aus Gly, Ser, Ala; Peptidbindung, Bindungslängen

2000 II 4 Protein: Strukturformelausschnitt, räumlicher Bau der Peptidbindung

2000 IV 2 Glycin + NaOH, pH, Pufferwirkung, Hydrolyse eines Proteins

2001 IV 4 Dipeptid, Tripeptid, Peptidbindung (NH-Gruppe schwach basisch)

2002 I 3 Elektrophorese Proteingemisch

2002 IV 4 Wolle, räumlicher Bau

2004 II 1 Amin aus Val, Basizitätsvergleich mit Anilin, Elektropherogramm, Dipeptid Phe-Asp